Przełomowe odkrycie biomarkera nielegalnych praktyk w produkcji mleka

Wprowadzenie do badania: Czy biomarkery w mleku ujawniają nielegalne praktyki?

Badanie kohortowe przeprowadzone przez zespół badawczy z Włoch i Hiszpanii koncentrowało się na poszukiwaniu biomarkerów w mleku krów, które mogłyby wskazywać na nielegalny zabieg podawania rekombinowanego bydlęcego hormonu wzrostu (rbST). Badanie miało charakter długoterminowy, z analizą próbek archiwalnych z lat 2016-2017 oraz nowych próbek terenowych z lat 2022-2023.

Populacja badana obejmowała dziewięć krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej z wcześniejszego eksperymentu przeprowadzonego w Hiszpanii, gdzie sześć krów otrzymywało rbST, a trzy stanowiły grupę kontrolną. Dodatkowo badano próbki od sześciu krów z gospodarstw we Włoszech. Wybór rasy holsztyńsko-fryzyjskiej nie był przypadkowy – stanowi ona około 95% pogłowia bydła mlecznego w Europie, dostarczając większość mleka konsumowanego w UE.

Jaki mechanizm działania bydlęcego hormonu wzrostu?

Bydlęcy hormon wzrostu (bGH) lub somatotropina (bST) to hormon peptydowy wydzielany przez przednią część przysadki mózgowej, o sekwencji 190-191 aminokwasów i masie cząsteczkowej 22 kDa. Po uwolnieniu do krwiobiegu, bST dociera do receptorów w wątrobie, aktywując różne szlaki sygnałowe i promując uwalnianie insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1), który jest głównym modulatorem efektów wzrostowych bST. Hormon ten wpływa na metabolizm, skład ciała i funkcje sercowo-naczyniowe, oddziałując nie tylko na siłę mięśni, ale także na inne procesy fizjologiczne związane z regeneracją komórkową.

Pierwsze korelacje między podawaniem hormonu wzrostu a galaktopoezą u krów mlecznych pochodziły z badań nad ekstraktami przysadki mózgowej podawanymi bydłu. Następnie potwierdzono, że jednym z efektów działania somatotropiny jest znaczący wzrost wydajności mlecznej, osiągany poprzez opóźnienie inwolucji gruczołów mlecznych i wzmocnienie utrzymania komórek wydzielniczych, przedłużając tym samym produkcję mleka poza szczyt laktacji. Wraz z rozwojem biotechnologii opartej na technologii DNA i inżynierii genetycznej, stała się możliwa synteza rekombinowanej bydlęcej somatotropiny (rbST) na dużą skalę.

Czy miRNA z pęcherzyków EVs odsłaniają sygnały rbST?

Badanie skoncentrowało się na analizie mikroRNA (miRNA) zawartych w pęcherzykach pozakomórkowych (EVs) mleka. MiRNA to małe, niekodujące RNA, które są zamknięte w EVs, co chroni je przed degradacją w niekorzystnych warunkach. Naukowcy wyizolowali EVs z mleka, przeprowadzili sekwencjonowanie małych RNA oraz potwierdzili wyniki za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR).

Wszystkie próbki zostały poddane wstępnej ocenie przed sekwencjonowaniem i analizą qPCR, w tym analizie śledzenia NTA, jakości mleka, składu mleka i odzysku RNA. Próbki archiwalne, przechowywane w temperaturze -20°C przez ponad 6 lat, nadal wykazywały akceptowalne profile zarówno pod względem rozkładu wielkości EVs, jak i stężenia, chociaż najwyższe stężenia pęcherzyków i najniższe odchylenie standardowe w rozkładach szerokości EV odnotowano dla nowszych próbek terenowych.

Kluczowym odkryciem badania była identyfikacja 35 różnicowo ekspresjonowanych miRNA pomiędzy krowami leczonymi rbST a grupą kontrolną. Szczególną uwagę zwrócono na bta-miR-10167-3p, które wykazywało konsekwentnie podwyższoną ekspresję u krów otrzymujących rbST. Walidacja za pomocą qPCR potwierdziła znaczącą nadekspresję tego miRNA zarówno w porównaniu do krów kontrolnych z badania eksperymentalnego, jak i do krów z badania terenowego.

Analiza eksploracyjna PCA nie wykazała wyraźnego rozdziału między wszystkimi próbkami od krów leczonych rbST a próbkami kontrolnymi, gdy analizowano je razem. Jednak gdy analiza PCA była ograniczona tylko do próbek kontrolnych, zaobserwowano grupowanie wszystkich dziewięciu próbek zebranych w punkcie T0. Z kolei nie zaobserwowano wyraźnych rozdziałów w dwóch pierwszych składowych głównych przy zawężeniu PCA tylko do próbek od krów leczonych rbST.

W celu identyfikacji miRNA różnicowo ekspresjonowanych (DE) związanych z fizjologicznymi zmianami niezwiązanymi z leczeniem rbST (np. rytm dobowy, różne etapy laktacji), analiza typu Anova (edgeR) zidentyfikowała 353 DE-miRNA. Hierarchiczne grupowanie średniej ekspresji różnicowej grup (odległość euklidesowa, średnie powiązanie, grupowanie wierszy) definiuje 5 głównych klastrów.

Analiza krzywej ROC (Receiver Operating Characteristic) wykazała, że bta-miR-10167-3p może służyć jako potencjalny biomarker nielegalnego stosowania rbST. Przy punkcie odcięcia 1,534, metoda wykazała czułość 57,7% i swoistość 91,4% przy analizie próbek z badania eksperymentalnego. Po włączeniu próbek terenowych i obniżeniu punktu odcięcia do 0,0013, czułość wzrosła do 76,92%, a swoistość wyniosła 78,49%.

Jakie znaczenie mają molekularne odkrycia dla diagnostyki i dobrostanu zwierząt?

Kontekst badania jest istotny, ponieważ stosowanie rbST zostało zakazane w Unii Europejskiej od 2000 roku ze względu na obawy dotyczące dobrostanu zwierząt i potencjalnego wpływu na zdrowie konsumentów. Mimo to, istnieją doniesienia o nielegalnym stosowaniu rbST, co podkreśla potrzebę skutecznych metod monitorowania.

Wcześniejsze metody wykrywania rbST napotykały trudności ze względu na podobieństwo rekombinowanej formy do endogennego hormonu oraz krótki okres półtrwania rbST w organizmie. Podejście oparte na biomarkerach miRNA oferuje dłuższe okno detekcji i możliwość nieinwazyjnego pobierania próbek (mleko zamiast krwi).

Badacze zauważyli, że bta-miR-10167-3p odgrywa rolę w różnicowaniu i proliferacji preadipocytów bydlęcych oraz wpływa na ekspresję genów związanych z cechami produkcji mleka. Dalsze analizy wykazały wzbogacenie funkcji molekularnych związanych z wiązaniem białek cytoszkieletowych, organizacją pęcherzyków i błon komórkowych oraz specyficznych szlaków sygnałowych jak endocytoza, mTOR i AMPK.

Dostępna literatura sugeruje, że bta-miR-10167-3p odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu i proliferacji preadipocytów bydlęcych, działając wraz z elementami kolistego RNA, takimi jak circADAMTS16, jako endogenna sieć RNA w potranslacyjnej translacji specyficznych genów. Inne badanie dotyczące znaczących SNP związanych z cechami produkcji mleka u krów mlecznych wykazało obecność genu czynnika 7 L1 komórek T (TCF7L1) wśród innych istotnych genetycznych celów implikowanych w takim fenotypie wielocechowym. TCF7L1 jest celem genetycznym, dla którego bta-miR-10167-3p wykazał istotne efekty modulacyjne w niedawnym badaniu dotyczącym różnicowania i apoptozy preadipocytów bydlęcych.

Badanie podkreśla potencjał miRNA jako narzędzia diagnostycznego w programach kontroli pozostałości leków, oferując prostą, efektywną kosztowo metodę przesiewową. Autorzy zaznaczają jednak, że konieczne są dalsze badania w celu ustalenia referencyjnych poziomów ekspresji bta-miR-10167-3p w większej populacji krów mlecznych oraz oceny jego przydatności zarówno w indywidualnych, jak i zbiorczych próbkach mleka.

Zastosowana w badaniu strategia analizy małych RNA pozwoliła na identyfikację perturbacji docelowych miRNA, które mogą być związane z leczeniem rbST, poprzez odfiltrowanie różnicowej obfitości miRNA, które wykazują oczekiwane i znaczne zmiany podczas laktacji, bez istotnego związku z badanym nielegalnym leczeniem. Udana analiza archiwalnych próbek mleka, dostępnych z wcześniejszego badania na zwierzętach, potwierdza obecnie znaczenie zarządzania biobankiem i jego wkład w zasady 3R (redukcja, zastąpienie i udoskonalenie) w eksperymentach z udziałem zwierząt, zgodnie z dyrektywą UE 2010/63.

Wyniki tego badania mają istotne implikacje dla monitorowania nielegalnego stosowania rbST w produkcji mlecznej, co jest ważne zarówno dla dobrostanu zwierząt, jak i bezpieczeństwa żywności dla konsumentów.

Podsumowanie

Międzynarodowy zespół badawczy przeprowadził kompleksową analizę biomarkerów w mleku krów, koncentrując się na wykrywaniu nielegalnego stosowania rekombinowanego bydlęcego hormonu wzrostu (rbST). Badanie objęło analizę próbek od krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej z lat 2016-2017 oraz 2022-2023. Kluczowym odkryciem było zidentyfikowanie bta-miR-10167-3p jako potencjalnego biomarkera stosowania rbST, wykazującego czułość 76,92% i swoistość 78,49% przy odpowiednim punkcie odcięcia. Hormon rbST, zakazany w UE od 2000 roku, wpływa na metabolizm i produkcję mleka poprzez aktywację różnych szlaków sygnałowych i uwalnianie IGF-1. Nowa metoda wykrywania, oparta na analizie mikroRNA w pęcherzykach pozakomórkowych mleka, oferuje dłuższe okno detekcji i nieinwazyjne pobieranie próbek, co stanowi znaczący postęp w monitorowaniu nielegalnych praktyk w produkcji mlecznej i ochronie dobrostanu zwierząt.

Bibliografia

Benedetto Alessandro, Giaccio Nunzia, Arigoni Maddalena, Calogero Raffaele Adolfo, Regal Patricia, Lamas Alexandre, Martucci Francesca, Audino Valentina, Dervilly Gaud, Pezzolato Marzia and Bozzetta Elena. miRNome Characterization of Milk-Derived Extracellular Vesicles in Recombinant Somatotropin-Treated Dairy Cows. International Journal of Molecular Sciences 2025, 26(6), 21-29. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms26062437.